FUNDAMENTO
Esta técnica se basa en el principio de la hemoaglutinación indirecta. Los hematíes sensibilizados están constituidos por hematíes de ovino recubiertos por un antígeno toxoplasmático. Esta técnica permite detectar las IgG y las IgM anti – toxoplasmáticas. También es posible diferenciarlos tratando el suero con 2 – ME el cual inhibe el poder aglutinante de las IgM, aunque en esta práctica no vamos a realizar ese proceso. La presencia de anticuerpos anti-Toxoplasma gondii séricos provoca una aglutinación de los hematíes sensibilizados que se traduce en un velo rojo / marrón que tapiza el pocillo. En ausencia de anticuerpos específicos, estos hematíes se sedimentan en el fondo del pocillo como un anillo.
OBJETIVO
El objetido de esta práctica es la determinación cuantitativa de Ac séricos dirigidos contra la Toxoplasma gondii por hemaglutinación indirecta.
UTILIDAD CLÍNICA
Es especialmente importante el control en mujeres embarazadas, ya que produce malformaciones en el feto.
REACTIVOS
Hematíes sensibilizados.
Hematíes no sensibilizados.
BUF: tampón fosfato pH 7,2
Control + (dilución 1/80)
Control –Suero control (con hematíes no sensibilizados)
Reactivo control (con hematíes sensibilizados)
APARATAJE
Centrífuga
MATERIALES NECESARIOS
Placa microtiter
SSF
Pipetas automáticas y puntas.
Tubo de ensayo
Gradilla
PROCEDIMIENTO
Antes de empezar la realización de la práctica, el puesto de trabajo debe de estar adecuadamente preparado con los materiales necesarios y sin olvidar la bata y guantes.
Comenzaremos preparando una solución madre 1/40 echando 50 microlitros de suero + 1’95 mL de tampón.
En la placa microtiter, echamos 50 microlitros de solución tampón en los 10 pocillos.
A continuación, echamos 50 microlitros de solución madre 1/40 en el primer pocillo ,mezclamos bien y pasamos al segundo pocillo 50 microlitros. Así haremos sucesivamente para ir diluyendo la muestra. Al final, en el pocillo 6 desecharemos 50 microlitros, para que en cada uno de los pocillos nos quede un volumen final de 50 microlitos.
En el pocillo 7 echaremos 50 microlitros directamente de la solución madre, que mezclaremos con los 50 microlitros de tampón. Una vez mezclados nos desechamos de 50 microlitros.
En el pocillo número 9 y 10 añadimos 50 microlitros de control + y control – (este paso solo lo han hecho unos cuantos compañeros, ya que quedaba poco volumen de muestra y los controles solo sirven para ver como tienen que salir los resultados).
Por último, echamos 1 gota de hematíes sensibilizados a todos los pocillos menos al número 7en el que se añade 1 gota de hematíes no sensibilizados.
Al finalizar cada práctica el puesto de trabajo se debe limpiar/desinfectar adecuadamente con una mezcla de agua, lejia y jabón.
En la siguiente tabla se muestra el proceso descrito anteriormente, donde se ve más claro el proceso.
Esperaremos al menos 2 horas para poder ver la reacción, ya que no ocurre de manera espontánea. Simplemente taparemos la placa de microtiter con parafina para que no se contamine, y la dejamos reposar.
RESULTADOS
Como se puede observar en la fotografía, el título de nuestra prueba sería 2560 (es decir, dilución 1/2560), que es la máxima dilución a la que se observa aglutinación.Corresponde con el pocillo número 6.
La presencia de aglutinación en los 6 primeros pocillos indica la formación del aglutinado debido a que hay un equilibrio entre antígeno y anticuerpo.
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