FUNDAMENTO
Los ensayos inmunoenzimatos por su esoecificidad, sensibilidad y sencillez de manipulación, son una técnica muy habitual en los laboratorios de investigación y de análisis clínicos.
En este ensayo, el Ac que reconoce al Ag está unido a un enzima con capacidad para catalizar una reacción que da un producto coloreado.
OBJETIVOS
El objetivo de esta práctica es detectar la presencia o ausencia de IgGs bovinas en varias muestras problema mediante un ensayo de inmunodot.
REACTIVOS
Control positivo (suero sanguíneo bovino)
Control negativo (suero sanguíneo ovino)
Ac anti-IgG bovina conjugado con peroxidasa
Ovoalbumina
Tampón fosfato salino
Sustrato/Cromógeno
MATERIALES
Placas de nitrocelulosa
Cubeta de incubación, coloración lavado
Micropipeta o pipeta PasteuR
Frasco lavador con agua
MUESTRA
Suero sanguíneo.
PROCEDIMIENTO: 1. Aplicamos en cada ventana de la placa 5 μl de las muestras y controles y dejar que se seque al aire hasta que desaparezca la mancha. 2. Preparamos la solución de bloqueo mientras dejamos secar la membrana. Para ello, vertemos el contenido de la bolsa de ovoalbúmina sobre 50 ml de tampón fosfato salino. Agitamos la mezcla hasta conseguir una disolución homogénea (5mg/ml). 4. Cubrimos la placa de análisis con solución de bloqueo durante 30 min aproximadamente. 5. Retiramos la solución de bloqueo y lavamos con agua destilada. La placa está lista para realizar el inmunoensayo (nunca debe de estar seca).
6. Añadimos en cada pocillo 20 μl del Ac conjugado con peroxidasa e incubamos 10 min a temperatura ambiente.
7. Lavamos la placa con agua destilada y lo colocamos sobre la cubeta de coloración.
8. Añadimos en cada pocillo 5 μl de sustrato cromógeno. Dejamos que desarrolle el color unos minutos agitando ligeramente la solución. Detenemos la reacción de coloración cuando las señales de los controles positivos sean claras, Para ello, lavamos la placa con abundante agua. El mejor contraste de las señales positivas se obtienen cuando la membrana se seca completamente.
RESULTADO
