FUNDAMENTO
Las interacciones de un anticuerpo (Ab) con un antígeno (Ag) es la reacción fundamental de la inmunología.
Ab + Ag → Ab-Ag
La mayoría de los antígenos son proteínas. La identidad exacta de los grupos que reaccionan con el anticuerpo generalmente no se conoce. Los antígenos macromoleculares y los anticuerpos forman complejos que se vuelven insolubles y precipitan. Esta propiedad hace posible realizar ensayos cualitativos y cuantitativos en el sistema anticuerpo-antígeno.
OBJETIVO
El objetivo es introducir los principios de las interaciones Ag-Ac usando el procedimiento Ouchterlony.
UTILIDAD CLÍNICA
Para el estudio de las reacciones de Ag-Ac.
MUESTRA
A antisuero
REACTIVOS
B Suero total (Antígeno)
C Albúmina (Antígeno)
D IgG (Antígeno)
E Tampón en polvo Tª ambiente 1 Agarosa™ UltraSpec.
APARATAJE
Baño de agua.
Microondas.
MATERIAL NECESARIO
Cortadores de pocillos.
Probeta.
Matraz de Erlenmeyer
Envase de plástico o placa Pyrex
Micropipetas automáticas y puntas
Espátula o mondadientes
Agua destilada
Pipetas (5 o 10 ml)
Rotulador
Tubos Eppendorf
Toallas de papel
Papel de aluminio.
PROCEDIMIENTO
Antes de empezar la realización de la práctica, el puesto de trabajo debe de estar adecuadamente preparado con los materiales necesarios y sin olvidar la bata y guantes.
Preparación de la agarosa:
En un matraz o vaso de precipitados de 500 ml, agregar todo el contenido del paquete de tampón en polvo (componente E) a 225 ml de agua destilada. Agite el matraz o vaso de precipitados para disolver totalmente el polvo.
Añadir todo el contenido del paquete de Agarosa™ UltraSpec al matraz o vaso de precipitados (3 gr).
Agitar la suspensión para dispersar los grumos. Con un rotulador, indicar el nivel de volumen de la solución en el exterior del matraz o vaso de precipitados.
Se debe calentar (hasta punto de ebullición) la solución para disolver la agarosa. Durante el calentamiento, retirar ocasionalmente el matraz del calor y verificar que no haya partículas pequeñas y claras de agarosa. Continuar calentando con agitación ocasional. La solución final debe ser clara y transparente. Usar un microondas para fundir la agarosa y realizar pulsos de calentamientos durante 2 minutos agitando el matraz entre pulsos. Verificar que no haya pequeñas partículas claras de agarosa. La solución final debe ser clara y transparente.
Si se ha producido una evaporación detectable, agregar agua destilada para llevar la solución al volumen original marcado en el matraz o vaso de precipitados en el paso.
Enfriar la solución de agarosa a 55 °C en un baño de agua.
Preparar alícuotas de 25 ml de la solución de agarosa (55 °C) para cada uno de los grupos.
Preparación de las placas de Ouchterlony:
Usar una pipeta de 5 ml o 10 ml, pipetear cuidadosamente 5 ml de la agarosa líquida (enfriada a 55 °C) en cada placa, girando la placa para cubrir el fondo con agarosa.
Si la agarosa líquida contiene burbujas, agitar suavemente la placa para eliminarlas.
Permitir que la agarosa se solidifique. Esto tardará aproximadamente 10-15 minutos, en cuyo momento el gel aparecerá un poco opaco.
Preparación de los pocillos para las muestras:
Colocar la plantilla debajo de una de las placas para que el patrón esté en el centro de la placa. Las distancias entre los pocillos son importantes. Intentar seguir la plantilla con la mayor precisión posible.
Cortar los cinco pocillos con el cortador de pocillos (proporcionado en el kit) con un suave movimiento de perforación.
Retirar los tapones de agarosa con un palillo de dientes o una espátula de bordes planos.
Si la colocación del pocillo no es precisa, debe haber suficiente espacio en la placa para volver a cortar los pozos utilizando la plantilla.
Carga de las muestras en los pocillos:
Anotar la identificación de cada grupo en la parte superior de la placa antes de cargar las muestras.
Usando la misma pipeta, llenar los pocillos centrales de las tres placas con 30 microlitros de antisuero (anticuerpo) del tubo A.
-Placa 1:
Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A)
Pocillo superior izquierdo: suero entero (tubo B)
Pocillo superior derecho: suero entero (tubo B)
Pocillo inferior izquierdo: suero entero (tubo B)
Pocillo inferior derecha: suero entero (tubo B)
-Placa 2: realizada por mi.
Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A)
Pocillo superior izquierdo: suero entero (tubo B)
Pocillo superior derecho: albúmina (tubo C)
Pocillo inferior izquierdo: albúmina (tubo C)
Pocillo inferior derecha: suero entero (tubo B)
-Placa 3:
Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A)
Pocillo superior izquierdo: IgG (tubo D)
Pocillo superior derecho: albúmina (tubo C)
Pocillo inferior izquierdo: albúmina (tubo C)
Pocillo inferior derecho: IgG (tubo D)
Incubación:
Colocar las tapas en las placas.
Colocar con cuidado las placas cubiertas en la cámara de incubación sobre una capa de toallas de papel húmedas. No se deben invertir las placas.
Cubrir la cámara con una envoltura de papel de aluminio y dejar incubar a temperatura ambiente entre 24 y 48 horas para permitir que se formen líneas de precipitación.
RESULTADO
Placa 1: Reacción de identidad.
Se debe tener en cuenta la serie de líneas de precipitación que indican que muchos sistemas Ab-Ag pueden estar visibles.
Placa 2: Reacción de identidad parcial.
Los “espolones” (prolongaciones de las líneas de precipitación) pueden ser débiles. La albúmina es reconocida por el antisuero en forma purificada o como un componente del suero. El antisuero también reconoce muchos otros componentes del suero.
Mi placa se corresponde con la identidad parcial.
Placa 3: Reacción de no identidad.
Los “espolones” pueden ser débiles. IgG y albúmina son componentes inmunológicamente no idénticos a los del suero completo. Ambos son reconocidos por diferentes anticuerpos en el antisuero fabricado contra el suero de conejo completo.
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