FUNDAMENTO:
Después de preparar un hemolizado, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio aniónico. La hemoglobina A2 (HbA2) se eluye de forma específica bajo estrictas condiciones de pH y fuerza iónica, cuantificándose por lectura fotométrica a 415 nm.
OBJETIVO:
Determinar el porcentaje de hemoglobina A2 respecto de la hemoglobina total, utilizando una microcolumna de intercambio iónico para su separación.
UTILIDAD CLÍNICA:
En las distintas etapas del desarrollo -desde el embrión hasta el individuo adulto - diferentes hemoglobinas se sintetizan en un orden fijado y rigurosamente determinado. Al momento del nacimiento, aunque en diferentes concentraciones, son 3 las hemoglobinas presentes: hemoglobina (Hb) A, Hb fetal (Hb F) y Hb A2.
La Hb A2 es una proteína compuesta por 2 cadenas polipeptídicas alfa y 2 delta que dan lugar a la formación del tetrámero 2 2. La activación del gen que codifica para las cadenas tiene lugar poco antes del nacimiento, de manera que los niveles en el recién nacido son bajos (alrededor del 0,5 %) y alcanzan los valores normales del adulto aproximadamente a los 6 meses de vida.2 El porcentaje de Hb A2 en individuos normales oscila entre 1,8 - 3,2 %.
A pesar de que la concentración de esta Hb es baja en sujetos normales, su determinación es muy importante para el diagnóstico de algunos tipos de hemoglobinopatías cuantitativas.
MATERIALES:
Microcolumnas. Contienen resina de intercambio aniónico equilibrada.
Tubos de ensayo
Gradilla
Pipetas
Puntas de pipeta
Cubetas de fotometria
APARATAJE
Espectrofotómetro
REACTIVOS:
Tampón biológico 15 mmol/L, detergente 0,1 g/L, pH 7,6.
MUESTRA:
Sangre total recogida mediante procedimientos estándar.
La hemoglobina A2 es estable durante 8 días a 2-8ºC. Puede utilizarse heparina o EDTA como anticoagulante.
PROCEDIMIENTOS:
Preparación del hemolizado
1. Pipetear en un tubo de ensayo:
Sangre: 50 µL
Agua destilada: 200 µL
Agitar. Este hemolizado se utilizará en los pasos 3 y 7.
2. Destapar la parte superior de la Microcolumna, romper a continuación la lengüeta inferior y bajar el disco superior hasta el nivel de la resina, evitando comprimirla, con la ayuda del extremo plano de una pipeta. Dejar gotear hasta que el líquido alcance el nivel del disco, desechando el eluído.
3. Aplicar cuidadosamente sobre el disco superior:
Hemolizado: 50 µL --> Desechar el eluído
4. Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadir, procurando arrastrar los posibles restos del mismo:
Reactivo 200 µL --> Desechar el eluído
5. Colocar la microcolumna sobre un tubo de ensayo y añadir:
Reactivo 3,0 mL --> Recoger el eluído (Fracción HbA2)
6. Agitar bien y leer la absorbancia (A) de la fracción HbA2 a 415 nm frente a agua destilada
(AHbA2). La absorbancia es estable al menos durante seis horas.
LECTURA
1. Pipetear en un tubo de ensayo:
Agua destilada 12,0 mL
Hemolizado 50 µL
2. Agitar bien y leer la absorbancia a 415 nm frente a agua destilada (AHb total). La
absorbancia es estable al menos durante seis horas.
CÁLCULOS Y RESULTADOS:
(0,38*2)/(0,92*12)*100=6,9%
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