FUNDAMENTO
Interacción de anticuerpos y antígenos. Estas son útiles en la defensa del cuerpo contra infecciones bacterianas y virales y tóxicas.
OBJETIVO
Técnica cuantitativa muy sensible que se utiliza a menudo clínicamente para detectar los niveles de proteínas sanguíneas de los pacientes. En esta práctica, los estudiantes aprenderán a determinar cuantitativamente una concentración desconocida de un antígeno.
UTILIDAD CLÍNICA
Identificar y cuantificar la concentración de una proteína sanguínea concreta para su estudio.
REACTIVOS
Solución de anticuerpos.
Solución de antígeno estándar.
Agarosa UltraSpec™
Tampón en polvo .
MUESTRA
Proteína de concentración desconocida.
MATERIAL NECESARIO
Pipetas de 10 ml con su aspirador.
Cortadores para pocillos (“well cutters”).
Tubos eppendorf.
Micropipetas y puntas automáticas (5-50 μl) •
Regla.
Placa
Papel de aluminio.
Agua destilada.
Microondas. •
Vaso de 400 a 600 ml o frasco Erlenmeyer.
Vaso o frasco de 150 ml.
Baño de agua.
Probeta graduado de 250 ml.
APARATAJE
Estufa de incubación (37ºC) .
PROCEDIMIETO.
Antes de empezar la realización de la práctica, el puesto de trabajo debe de estar adecuadamente preparado con los materiales necesarios y sin olvidar la bata y guantes.
PREPARACIÓN DE LA AGAROSA
En un vaso de precipitados de 400 a 600 ml o Erlenmeyer, añadir todo el contenido del envase de Tampón en polvo (componente D) a 200 ml de agua destilada.
Agitar la solución hasta que el polvo esté totalmente disuelto.
Separar y guardar 50 ml para usar como tampón de dilución en un vaso de precipitados separado.
Añadir el contenido completo del paquete de agarosa (componente C) a un matraz o vaso de precipitados que contenga 150 ml de tampón. Agitar vigorosamente la solución para dispersar los grumos. Con un marcador, indicar el nivel de volumen de la solución en el exterior del matraz o vaso.
Cubrir el frasco con una envoltura de plástico para minimizar la evaporación.
Calentar la mezcla durante 1 minuto.
Agitar la mezcla y calentarla en intervalos de 25 segundos hasta que toda la agarosa esté completamente disuelta.
Enfriar la solución de agarosa a 55°C en un baño de agua.
PREPARACIÓN DE LAS PLACAS CON ANTICUERPOS
Verter 26 ml de solución de agarosa fundida en un tubo grande o en un matraz.
Añadir el contenido completo de la Solución de anticuerpos (Componente A) a la solución de agarosa caliente de 26 ml.
Mezclar la solución con una pipeta. Mantener la solución caliente (con el baño de agua a 55°C) para que no se solidifique prematuramente. La concentración del anticuerpo será de 1 mg/ml.
Con una pipeta de 10 ml, dispensar 2,5 ml en el fondo de cada placa de Petri, extender suavemente la agarosa con la pipeta para cubrir el fondo.
Dejar que la agarosa se solidifique aprox. 10 min.
PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS
Marcar 10 tubos de microtest como "Estándar".
Marcar 10 tubos de microtest como "Desconocido".
Marcar 10 tubos de microtest como "Tampón".
Alicuotar 75 μl de Solución de Antígeno Estándar (Componente B) en cada tubo microtest marcados como "Estándar". (En mi grupo hicimos este paso)
Alicuotar 10 μl de Solución de Antígeno Desconocida (Componente E) en cada tubo microtest marcado como "Desconocido".
Alicuotar 1 ml de Tampón (guardado de la etapa de preparación de agarosa del apartado 4.3 A) en cada tubo microtest marcado como "Tampón".
PREPARACIÓN DE LA CÁMARA DE INCUBACIÓN.
Conseguir un recipiente de plástico o un plato con tapa (que puedan entrar en el interior de la estufa de incubación). Si no hay una tapa disponible, el envase puede estar cubierto con una envoltura de plástico (film transparente).
Extender en la parte inferior del recipiente varias toallas de papel. Agregar agua destilada a las toallas hasta saturarlas de agua. Todo el líquido debe ser absorbido por las toallas.
Cubrir la cámara con papel de aluminio.
PREPARACIÓN DE LOS POCILLOS EN LAS PLACAS DE AGAROSA
Colocar la plantilla debajo de la placa para que el patrón esté centrado.
Realizar los pocillos utilizando el cortador de pocillos con un suave movimiento de perforación.
Retirar los tapones de agarosa con un palillo o espátula de borde plano.
PREPARACIONES DE LAS SOLUCIONES ESTÁNDAR
Marcar cuatro tubos de microtest: 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16.
Utilizando una micropipeta, añadir 50 μl de Tampón a cada tubo.
Con una punta de pipeta nueva, añadir 50 μl de "solución de antígeno estándar" al tubo con la etiqueta 1:2. Mezclar.
Con una punta de pipeta nueva, transferir 50 μl de la dilución 1:2 al tubo etiquetado 1:4. Mezclar.
Con una punta de pipeta nueva, transfiera 50 μl de la dilución 1:4 al tubo marcado con 1:8. Mezclar.
Con una punta de pipeta nueva, transfiera 50 μl de la dilución 1:8 al tubo marcado con 1:16. Mezcla.
DILUCIÓN CONCENTRACIÓN: Sin diluir 2 mg/ml 1:2 1 mg/ml 1:4 0,5 mg/ml 1:8 0,25 mg/ml 1:16 0,125 mg/ml
CARGA DE LOS PATRONES Y LA MUESTRA
En la parte inferior de la placa, numerar los pocillos en el perímetro de la placa del #1 a #5. Dejar el pocillo del centro sin marcar (sin número).
Cargar los pocillos 1 a 5 con la misma micropipeta o pipeta de transferencia. En el pocillo 5, cargar 5 μl de la dilución de antígeno 1:16. Asegurarse que la muestra cubre toda la superficie del pocillo extendiéndola cuidadosamente con la punta de la pipeta.
En el pocillo 4, cargar 5 μl de la dilución de antígeno 1:8.
En el pocillo 3, cargar 5 μl de la dilución de antígeno 1:4.
En el pocillo 2, cargar 5 μl de la dilución de antígeno 1:2.
En el pocillo 1, cargar 5 μl del antígeno no diluido .
RESULTADOS
Según el problema, cuyo diámetro es 1,2 cm elevado al cuadrado 1,44 cm, su concentración es aproximadamente 0,5 mg/ml.
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