PRÁCTICA Nº10: IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS EN SUERO.

FUNDAMENTO

Las proteínas en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético.

OBJETIVO

Obtener las cinco fracciones correspondientes a diferentes proteínas plasmáticas con carga negativa decreciente, para su cuantificación:

-Albúmina.

-Alfa 1 globlulina.

-Alga 2 globulina.

-Beta globulina.

-Gamma-globulina.

UTILIDAD CLÍNICA

Identificación y cuantificación de proteínas para seguimiento y diagnóstico de enfermedades.

MUESTRA

Suero

REACTIVOS

• Solución tampón.

• Colorante rojo Ponceau.

• Decolorante rojo Ponceau.

• Solución transparentadora.

• Solución disolvente.

MATERIAL NECESARIO

• Alimentador para electroféresis.

• Cubeta de electroféresis.

• Aplicador.

• Tiras de acetato de celulosa.

• Láminas Mylar.

• Papel de filtro.

• Agua destilada.

PROCEDIMIENTO

Antes de empezar la realización de la práctica, el puesto de trabajo debe de estar adecuadamente preparado con los materiales necesarios y sin olvidar la bata y guantes.

1. Preparación del buffer para técnica semimicro: tomar 100 ml de Tris Hipurato concentrado para 1000 ml de agua destilada.

2. Preparación del decolorante: preparar 1000 ml de una disolución de ácido acético 5%.

3. Equilibrio de las tira: introduzca una o mas tiras en 100 ml de buffer.

4. Preparación de la cámara de electroforesis: llenar la cubeta con el tampón.

5. Secado de las tiras: coloque las tiras impregnadas de buffer entre dos hojas de papel de filtro para retirar el exceso de tampón.

6. Colocación de las tiras en el puente y aplicación del suero: colocar las tiras con la cara absorvente hacia arriba y con la esquina inferior hacia la derecha (Sumergiendo los bordes). Aplicamos la muestra en la tira con el aplicador adecuado, a unos 2 cm del borde.

7. Tiempo y voltaje: 200 V durante 35 min.

8. Sumerjer las tiras en rojo Ponceau durante 5 min.

9. Decolorar las tiras en ácido acético, 3 o 4 baños hasta obtener fondo blanco.

10. Transparentador: sumerjer la tira en el transparentador durante 1 min y a continuación colocar la tira sobre una superficie de Mylar film y para eliminar el exceso de líquido utilizar rodillo.

11. Calentar a 80ºC en estufa durante 10 min.

12. Cuantificado por fotodensitometría: medir la tira con en un fotodensitómetro.

RESULTADOS

En mi caso el resultado es erroneo, ya que la cubeta de electroforesis estaba defectuosa y no dejaba pasar la corriente eléctrica.