FUNDAMENTO
Después de preparar un hemolizado, donde se elimina la fracción lábil, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio catiónico eluyéndose de forma específica la Hb A1c previa eliminación por lavado de HbA1 a+b.
OBJETIVO
Obtener la lectura de la absorbancia
APARATAJE
Espectofotómetro de absorción Thermo electron.
REACTIVOS
Reactivo 1: 30 ml Biftalato potásico 50 mmol/L y detergente.
Reactivo 2: 50 ml Tampón fosfato 48 mmol/L y azida sódica 0,95 g/L.
Reactivo 3: 450 ml. Tampón fosfato 72 mmol/L y azida sódica 0,95 g/L.
Microcolumnas: resina de intercambio catiónico equilibrada.
MUESTRA
Sangre total con EDTA como antivoagulante.
MATERIAL NECESARIO
Micropipetas con sus puntas correspondienres.
Pipeta de 2 y 4 ml con el aspirador.
Vaso para desechar los restos.
Cubetas.
Portacubetas.
Gradillas.
Tubo largo.
Tubos de ensayo.
PROCEDIMIENTO
Antes de empezar la realización de la práctica, el puesto de trabajo debe de estar adecuadamente preparado con los materiales necesarios y sin olvidar la bata y guantes.
Preparación del hemolizado y eliminación de la fracción lábil:
1. Dejar atemperar reactivos y columna durante unos minutos.
2. Pipetear en un tubo de ensayo: 50 μl de Sangre y 200 μl de reactivo 1.
3. Agitar y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 min.
Preparación de la columna:
4. Destapar la parte superior de la columna, sacar el tapón inferior y bajar el disco superior hasta el nivel de la resina, evitando comprimirla, con la ayuda del extremo plano de la pipeta. Dejar gotear hasta que el líquido alcance el nivel del disco, desechando el eluido.
Separación y lectura de HbA1c:
5. Aplicar sobre el disco: 50μl del hemolizado y desechar el eluido.
6. Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadir: 200 μl de reactivo 2 y desechar el eluido. Dejar gotear hasta que el Reactivo 2 alcance el disco superior.
7. Pipetear 2 ml del Reactivo 2 y eliminar el eluido.
8. Colocar la columna sobre un tubo de ensayo y añadir 4 ml de Reactivo 3 y recoger el eluido que es la fracción de Hb que nos interesa.
9. Agitar bien, añadir a una cubeta y leer la absorbancia a 415 nm frente a un blanco (agua destilada).
Lectura de Hb total:
10. Pipetear en un tubo de ensayo: 12 ml de reactivo 3 y 50 μl del hemolizado.
11. Agitar bien, añadir a una cubeta y leer la absorbancia a 415 nm frente a un blanco (agua destilada).
CALCULOS Y RESULTADOS
A HbA1c: 0, 130.
A Hb total: 0,420.
(0,130*100)/ (3*0,420)= 10,31 %
VALORES
Los valores normales son entre 4,2 - 6,2 %, por lo que el resultado en esta muestra está por encima de los niveles normales.
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